前沿|circRNA ONT長讀長測序

研究背景

環狀RNA(circRNA)是一類知之甚少的非編碼RNA,其中一些已被證明對細胞增殖和發育具有功能重要。CircRNA主要來自編碼mRNA的反向剪接事件,使得難以區分circRNA與線性剪接的mRNA的內部外顯子組成。為了檢查circRNA的全局外顯子組成,作者使用納米孔技術對人和小鼠腦源RNA進行了單分子長讀長測序。

研究方法

將總人或小鼠腦組織RNA進行DNA酶處理并去除rRNA,然后用RNase R處理以消化線性RNA。為了進一步富集circRNA,將剩余的線性RNA多聚腺苷酸化(poly A tailing)并使用poly(A)純化磁珠去除帶polyA尾的RNA分子。收集富含circRNA的上清液并將其片段化(溫和水解切口)以使circRNA線性化。從3’末端除去磷酸基團并在線性化RNA的5’末端添加磷酸基團后,對獲得的RNA庫進行多聚腺苷酸化,以與ONT測序方案一致。接下來進行ONT全長轉錄組建庫。

研究結果

1、ONT circRNA測序方法

只有一小部分RNA是環狀的(例如,小鼠神經系統中去rRNA的RNA庫中僅占約0.1%)。作者采用上述方法進行circRNA-ONT測序,由于有些線性RNA分子對RNase R具有抗性,故而此方法比普通的去線性circRNA建庫多了一步:將剩余的線性RNA多聚腺苷酸化(poly A tailing)并使用poly(A)純化磁珠去除帶polyA尾的RNA分子。結果表明,該步驟使circRNA強烈富集。

2、circRNA nanopore測序數據產出

人和小鼠circRNA文庫的納米孔測序分別產生0.67M和1.06M reads,其中3.2%和3.3%跨越circRNA BSJ(Back splice junction)位點。人和小鼠中分別鑒定到7,834和10,975個circRNA,其中1,319個在人和鼠中保守的circRNA。在最高表達和保守的circRNA中,發現眾所周知的腦circRNA,例如circRims1、circRims2、circHipk3、circCdyl和circZfp609。整個數據集中,分別來自人和小鼠的2,945和7,052個circRNA先前未在circBase中注釋。

兩個高豐度circRNA:Hipk3和Zfp609(具有可變3’剪接位點的新型外顯子)的外顯子分布圖分別顯示在下圖:

3、長讀長測序全面繪制circRNA外顯子-內含子組成

將所有小鼠和人跨越BSJ reads與各自的參考基因組比對,并定量比對到外顯子或內含子區域的堿基對的數量。為了將分析集中于更豐富的circRNA中的內含子保留和其他可變剪接事件,僅進一步研究了具有10個或更多BSJ reads并具有高于3%的平均內含子百分比的circRNA。作者發現3個人和4個小鼠circRNA具有內含子保留,而39和57個circRNA包含分別在人和小鼠的RefSeq中未注釋的外顯子序列。CAMSAP1 是circRNA內含子保留實例,其僅發生在人RNA中;LPXN circRNA是僅在人中表達的circRNA。

可選擇性外顯子使用是人和小鼠circRNA中的普遍現象,circRNA的可變剪接模式通常在小鼠和人之間共享。circRNAs中使用的大多數外顯子都在RefSeq中注釋,但值得注意的是,人和小鼠表達良好的外顯子(>5 reads)中1.9%(73個外顯子)和2.1%(96個外顯子)分別是新的、以前未在RefSeq中注釋過。僅觀察可變剪接的外顯子,人和小鼠中新外顯子的百分比分別增加到8.7%(21個外顯子)和6.8%(12個外顯子)。對于人circPPP6R2和circRBM23以及小鼠circBrsk2和circNrxn1(下圖A-D)顯示了廣泛的可變剪接事件實例,其中circPPP6R2為包含未注釋外顯子的circRNA的實例。

4、circRNA新外顯子使用進一步分析

將circRNA根據新外顯子使用分類為“隱蔽的circRNA外顯子”(與注釋的外顯子共享5’或3’剪接位點)或“獨特的circRNA外顯子”(全新的外顯子)。人類2,393個外顯子中的91個和小鼠中2,487個外顯子中的82個是獨特的circRNA外顯子,140和163個分別是隱蔽的circRNA外顯子。(所有單外顯子circRNA都被排除在該分析之外,因為在單個read中需要完全覆蓋檢測到的外顯子,這對于單個外顯子circRNA而言在技術上是不可能的。)作者發現大多數獨特的circRNA外顯子在40-200bp范圍內,但也經常觀察到3-6bp的非常短的外顯子(微外顯子)組。有趣的是,大多數circRNA特異性外顯子導致移碼突變或終止密碼子獲得,可能解釋了它們在線性mRNA翻譯中缺失,因此受到無義介導降解。

小結

納米孔測序技術提供了一種快速可靠的方法來繪制circRNA的特定外顯子組成。

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參考文獻:

Rahimi K, Veno M T, Dupont D M, et al. Nanopore sequencing of full-length circRNAs in human and mouse brains reveals circRNA-specific exon usage and intron retention[J]. BioRxiv, 2019: 567164.

 

 

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