【項目文章】強大的四倍體雜交水稻

轉錄組分析新型四倍體水稻與育性和雜種優勢特異相關的差異表達基因
Scientific Reports 2016

研究背景

水稻是最重要的糧食作物之一,在過去的50年里,通過雜交育種已經大幅度提高了水稻的產量。然而雜交育種最近幾年也遇到了瓶頸,多倍體化則成為水稻育種的另一條思路。多倍體化能夠提高優勢基因發生重組和相互作用的可能性,提高水稻對環境的適應能力。

同源四倍體水稻(autotetraploid rice)是二倍體水稻經過染色體加倍形成的新種質。同源四倍體水稻亞種間雜種F1具有強大的生物學優勢,蘊含著巨大的增產潛力,可望成為未來水稻育種的新途徑。然而,其雜種F1普遍存在育性偏低,產量優勢難以發揮,在農業生產上難以直接應用的問題。所以,如何創制育性正常且能克服雜種F1不育性的新型四倍體(neo-tetraploid)是利用其優勢的關鍵。

為了避免同源四倍體水稻育性偏低的問題,華南農大某研究組經過20年的努力,培育出2個新型四倍體水稻,其結實率可達80%以上,于2016年獲得國家植物新品種權。本研究旨在通過轉錄組測序,研究新型四倍體(Huaduo 3)與同源四倍體雜交F1代的花藥、子房和葉片的基因表達情況,為解析新型四倍體育性和雜種優勢的分子機制打下基礎。

材料方法

新型四倍體水稻Huaduo 3(H3),40種不同的同源四倍體水稻,以及雜交F1代。同源四倍體水稻 Huajingxian 74-4x(T452)與H3的雜交F1代用于測序分析。
轉錄組測序:取T452,H3及雜交F1代的三種不同組織分別進行轉錄組測序,包括減數分裂階段的花藥、減數分裂階段的子房、開花階段的旗葉。每個組織每種品系有3個生物學重復,共27個樣品。測序平臺為Illumina HiSeq 2500,平均每個樣品測約5G。
小RNA測序:取T452,H3及雜交F1代的減數分裂階段的花藥進行小RNA測序,無生物學重復。
全基因組重測序:兩個親本T452和H3的葉片DNA用于全基因組重測序。
嗯,測序手段還是挺多滴!

技術路線

 

研究結果

1.新型四倍體水稻Huaduo 3(H3)的育種及其與其它四倍體水稻的雜交過程
將兩種同源四倍體水稻(Jackson-4x和96025)進行雜交,獲得F1代雜交種。F1代雜交種再進行連續自交,到F5代時發現一株水稻有80%的結實率,這株水稻經過多代連續自交,到F10-F13代時出現可以穩定遺傳的高結實率性狀,這個品系被命名為Huaduo 3(H3)。H3不僅結實率高,還有其它高產性狀(表1),其花粉母細胞有90%以上是正常的。
將H3與40種其它品系的同源四倍體水稻(26個印度種和14個日本種)進行雜交,獲得的40種F1代表現出了很多大大優于親本的性狀,尤其是單株谷粒數、結實率、單株產量等性狀。為了進一步研究雜交F1代的雜種優勢,我們挑選了T452和H3的雜交F1代進行轉錄組研究。T452是一種育性較低的同源四倍體,雜交F1代的高親優勢幾乎都是正的,除了谷粒長度和10谷粒寬度兩個指標。雜交F1代的中親優勢除了10谷粒寬度這一個指標以外都是正的,說明雜交F1代表現出了明顯的雜種優勢。
高親優勢(High-parent heterosis,HPH)是指雜交F1代的產量或者某一數量性狀的數值與高值親本(HP)同一性狀數值差值的比率。高親優勢(%)=(F1-HP)/HP*100%。
中親優勢(Mid-parent heterosis,MPH)指雜交F1代的產量或者某一數量性狀的數值與雙親(P1和P2)同一性狀的平均值差值的比率。中親優勢(%)=[F1-(P1+P2)/2]/(P1+P2)/2*100%。

表一:T452與H3雜交F1代的雜種優勢。HPH:高親優勢;MPH中親優勢;PH:植株高度;EP:單株谷粒數;FG:單花谷粒數;SS:結實率;GYP:單株產量;GL:10谷粒長度;GW:10谷粒寬度。

圖1:親本和雜交F1代的表型。(A)Jackson-4x(T45),Huaduo 3(H3)與96025(T44)的谷粒大小,H3是來自T45和T44的雜交;(B)H3在大田中的長勢;(C)T45,H3,T44的植物表型;(D)Shennong15-4x(T424),H3,以及兩者雜交F1代的表型。

2.轉錄組測序
因為T452和H3的雜交F1代表現出了優良性狀,因此可以通過轉錄組測序研究性狀差異的原因。取T452,H3及雜交F1代的三種不同組織分別進行轉錄組測序,包括減數分裂階段的花藥、減數分裂階段的子房、開花階段的旗葉。總共測了548M clean reads,平均有89.06%的reads可以比對到參考基因組上,其中93.45%都是比對到唯一位置上。三個生物學重復之間的相關性都達到了0.8以上。用qRT-PCR的方法對12個差異表達基因(DEG)的表達量進行了驗證,結果與轉錄組測序的結果一致。對不同樣品進行層次聚類分析表明,相同組織的樣品總能聚到一塊(圖2)。

圖2:所有基因的層次聚類分析。AN:花藥;OV:子房;LE:葉片。

3.差異表達基因(DEG)分析及注釋
在三個不同株系中共發現17877個DEG,兩兩比較的DEG數目在1521到2498之間(表2)。F1和親本之間的DEG稱為DEGF,親本之間的DEG稱為DEGP。DEGF的基因能分為兩個不同的組,其中一個組在DEGP里面也有,另一個組只屬于DEGF,后者被稱為DEGFu。這些DEGFu基因能夠解釋F1和親本之間的表型差異,因此接下來的研究種重點關注DEGFu基因。在這17877個DEG里面,有1150,1014,1122個DEGFu與花藥、子房、葉片有關,其中分別有807,663,866個基因與花藥、子房、葉片特異相關,這些基因被稱為DEGFu-sp。

表2:三個不同組織中的差異表達基因統計。AN:花藥;OV:子房;LE:葉片。

為了研究DEGFu-sp基因的功能,我們首先研究了其中的轉錄因子,共發現了44個轉錄因子,花藥里面16個,子房里面10個,葉片里面18個。對DEGFu-sp基因的蛋白互作網絡分析表明這些基因相互之間有顯著的聯系,多個代謝通路富集程度較高。

GO富集分析表明花藥中的DEGFu-sp基因有19個生物學過程類別顯著富集,包括光合作用、代謝途徑、合成調控和轉錄調控。6個通路類別顯著富集,包括光合作用和代謝通路。13個基因在F1中的表達量顯著高于T452。在807個花藥特異的DEGFu-sp中,15個基因與46個其它重要基因共表達。

接下來用同樣的方法對子房和葉片中的DEGFu-sp基因進行了GO富集分析。在葉片當中有5個基因在F1中表達量顯著高于T452。H3水稻葉片在開花過程中顏色逐漸變化,而T452葉片在開花過程中顏色保持不變。因此,我們比較了葉片中F1比T452上調的基因,以及H3比T452上調的基因,兩者有74.01%的重合。有趣的是,在葉片中發現了兩個主要的功能基因類別,分別是程序性細胞死亡和防御反應。

4. 花藥特異性差異表達基因與減數分裂有關

因為T452育性較低,而F1代育性較高,為了研究育性的差異,我們重點研究了F1花藥中與T452相比上調的基因。首先,有643個基因在F1花藥中與T452相比特異上調,這其中排除了H3與T452相比上調的基因。對這643個基因進行GO分析表明,有6個功能基因類別富集,這些基因與防御反應、光合作用、細胞凋亡和程序性細胞死亡有關。這其中有41個基因在育性較低的同源四倍體中表達量低于二倍體。在這41個基因中,4個基因,LOC_Os04g33830,LOC_Os12g08770,LOC_Os06g21590,LOC_Os07g25430,與光合作用有關。

接下來,將這643個特異上調的基因與野生型水稻花藥減數分裂相關基因的表達量相互比較,發現有9個基因都在減數分裂前期到四分體期表達。

隨后,我們比較了花藥特異性差異表達基因DEGFu-sp和野生型水稻減數分裂相關基因表達數據,共發現有42個減數分裂特異性基因和8個減數分裂相關基因(圖3)。在8個減數分裂相關的基因中,有兩個基因和DNA修復和染色體結構有關。

因為轉錄組也會被表觀遺傳調控,我們也進了小RNA測序。在花藥中發現了288個差異表達的miRNA(DER),其中有13個為新發現的。在這288個DER中,有38個只在F1與親本相比中特有,這38個基因被稱為DERFu。這38個DERFu有397個靶標基因。GO分析表明這397個靶標基因有7個功能基因類別富集,這些基因與細胞凋亡、防御反應、程序性細胞死亡、細胞自噬、DNA完整性和脅迫反應有關。而且,大部分靶標基因同于F1或者H3中上調的基因。然后我們比較了這38個DERFu與之前發現的差異表達miRNA數據,發現其中一個miRNA,osa-miR5072_L-2_1ss3AG,在

Taichung65-2x和 Taichung65-4x水稻中的四倍體中下調。這個miRNA靶標基因為 LOC_Os02g24960,是一個逆轉錄轉座子基因。

圖3:與育性和雜種優勢相關的基因在染色體上分布。紅色為葉片中的基因,藍色為花藥中的基因,黑色為子房中的基因。

表3:花藥中的差異表達miRNA(DER)列表

5.雜交F1代非累加基因表達
F1代表達的基因可以分成兩個類別,一類是累加基因,一類是非累加基因。累加基因的表達量來自兩個親本的等位基因之和,非累加基因的表達量由兩個親本等位基因的平均值決定。在三個組織中共發現了1224個非累加基因(NDEG),在花藥、子房和葉片中分別為314個,578個,332個。其中895個上調,329個下調。通過對花藥NDEG和水稻花藥減數分裂特異性基因表達數據的比較,發現了53個共有的基因。其中有7個基因在四倍體中表達量低于二倍體水稻。

表4:非累加表達基因(NDEG)和DEGFu及不同組織的DEGFu-sp數量統計。星號表示NDEG在F1表達的總基因中的比例。

6.DNA序列差異與雜交F1代的差異表達基因之間的關系
DNA重測序表明T452和H3有很多序列差異,兩者共有2351039個SNP,其中1192412個SNP在T452中特異存在,374460個SNP在H3中特異存在。兩者共有499448個Indel,其中248194個Indel在T452中特異存在,84196個Indel在H3中特異存在。將T452和H3相比,SNP和Indel多態性分別為66.77%和69.97%。在這些多態性位點中,約65%的SNP和72%的Indel在基因區。47.67%的SNP和53.37%的Indel位于差異表達基因的調控區域。另外,有58908個SNP和5561個Indel位于基因編碼區。
因為T452和H3存在大量的DNA序列差異,我們分析了DEGFu-sp中基因的DNA序列差異,結果表明花藥、子房和葉片中分別有330個、291個、459個基因存在DNA序列差異(SNP或Indel)。花藥相關的330個基因可以分為15個不同的生物學過程類別,主要和光合作用、細胞代謝、轉錄和生物合成有關。子房相關的基因有1個生物學過程富集,即代謝通路。同樣的,葉片相關的基因有8個生物學過程富集,包括氮代謝、細胞運輸等。這些富集的生物學過程基本上與DEGFu-sp富集的生物學過程一致。
另外,非累加差異表達基因中也有SNP和Indel,花藥、子房和葉片中分別有67個、133個、87個基因存在DNA序列差異,并對這些基因進行了富集分析。其中25個基因為轉錄因子。

結論

本研究培育了一個新型四倍體水稻H3,H3與同源四倍體T452雜交產生的F1代具有育性高、產量高等優良的雜種優勢性狀。通過比較H3,T452,以及雜交F1代的三個不同組織(花藥、子房、葉片)的轉錄組差異,尤其是重點分析了花藥的轉錄組差異,找到了多個與減數分裂有關的差異表達基因,這些基因可能與雜種優勢有關。對花藥的小RNA測序也找到了一些F1中差異表達的miRNA,這些miRNA的靶基因也與轉錄組測序中上調的基因有大部分重合,說明miRNA可能參與調控了雜交F1代的性狀差異。對兩個親本DNA序列的差異進行全基因組重測序分析,并與轉錄組數據進行聯合分析,找到了DNA層面上兩者育性差異的可能原因。

創新點

培育出高結實率的新型四倍體水稻,可以用于四倍體水稻育種;
轉錄組測序比較了新型四倍體水稻,同源四倍體水稻及雜交F1代不同組織的轉錄組差異,找到了影響四倍體水稻育性和雜種優勢的相關基因;
小RNA測序和全基因組重測序結果與轉錄組數據相結合,深入解析性狀差異原因。

點評

這篇文章選取的實驗材料很好,性狀優良,而且研究得很深入,比較了三種水稻三個不同組織的轉錄組,還進行了小RNA測序和全基因組重測序。通過深入分析,找到了一些影響水稻育性和雜種優勢的相關基因,為后續的育種工作打下了基礎。
對多種測序手段結合分析感興趣的小伙伴快來試試吧!

參考文獻

Guo H, Mendrikahy J N, Lei X, et al. Transcriptome analysis of neo-tetraploid rice reveals specific differential gene expressions associated with fertility and heterosis[J]. Scientific reports, 2017, 7:40139.

推薦文章
排列五开奖号码